Asegurarse de que un experimento salga bien es una prioridad principal porque ahorra tiempo, dinero y evita la frustración general del trabajo. En muchos protocolos de extracción de ADN, el uso de proteinasa K es un paso importante debido a su capacidad para digerir nucleasas dañinas, pero a veces puede ser un misterio cuánto usar, cuándo usarlo y por cuánto tiempo. En este artículo, desentrañamos 5 preguntas comunes sobre la proteinasa K que se relacionan estrechamente con los métodos de extracción. Si bien esperamos que este artículo te sirva como una guía útil en tu trabajo, es fundamental realizar una investigación adicional para asegurarse de que tus métodos coincidan perfectamente con el tipo de trabajo que se está realizando.
¿Cuándo se usa proteinasa K?
La proteinasa K se utiliza principalmente en protocolos de extracción de ADN y ARN. A menudo encontrará el paso de proteinasa K dentro de la sección de lisis del protocolo. Por ejemplo, en el protocolo de extracción de ácidos nucleicos, se agrega proteinasa K al lisado celular y luego sigue un período de incubación para asegurar una digestión completa.
Para evitar la posible digestión de sus muestras, la proteinasa K se inactiva después de la incubación. La temperatura habitual de inactivación es de 95 ° C.
Incluso en el protocolo típico de cola de ratón, la proteinasa K se usa regularmente para inhibir las nucleasas dañinas. Y la adición de proteinasa K ocurre durante el paso de digestión. También se sugiere el uso de EDTA para ayudar a la inactivación de nucleasas, ya que inhibe las nucleasas dependientes de Mg2+.
¿Cómo sé si ha ocurrido la digestión?
Por lo general, el mayor indicio de que se ha producido una digestión completa es que debería ver una solución celular clara y lisada. Si no ve una solución clara después del período de digestión inicial, extienda el tiempo de incubación.
Sé muy cuidadoso con esto. Si estás utilizando un método rápido para el aislamiento, especialmente con volúmenes más altos de proteinasa K, deberás prestar mucha atención durante la digestión de proteinasa K. Una digestión más prolongada puede provocar la degradación de tu ADN.
¿Cuánto tiempo de incubación debo usar?
El período de incubación con proteinasa K dependerá principalmente del tipo de muestra con la que estés trabajando. Después de investigar un poco, este es el rango de tiempos que encontramos para diferentes muestras de células y tejidos. Ten en cuenta que tu experimento puede tener diferentes requisitos o variables que podrían influir en gran medida en los tiempos de digestión y, por lo tanto, te recomendamos que hagas tu propia investigación antes de realizar el trabajo.
Tejidos incrustados en parafina fijados con formalina: digerir durante varias horas o toda la noche.
* Nota: Los tejidos incrustados en parafina fijados con formalina suelen aparecer en forma abreviada como FFPE (del inglés Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues). Este es un método para la conservación de tejidos (otro método de conservación de tejidos a largo plazo es con tejido congelado).
- Bacterias – Digerir con proteinasa K entre 1-3 horas. La temperatura de digestión también puede influir en la duración de la digestión.
- Células de mamíferos: existen varios artículos con una amplia gama de tiempos de digestión establecidos, desde 1 hora hasta doce horas. Esto se debe en parte a los objetivos experimentales y al tipo de células utilizadas. La temperatura de digestión y los volúmenes de proteinasa K también tienen cierta influencia.
¿Qué temperatura debo utilizar para la digestión con proteinasa K?
Las temperaturas de digestión también varían según el tipo de muestra con la que se esté trabajando. Una vez más, ofrecemos una guía sobre esto, pero le recomendamos que investigues más para optimizar todas las condiciones antes de continuar con tu experimento.
- Tejido FFPE: Temperaturas de digestión 55-56 °C. La mayoría de los artículos son bastante consistentes con ese rango de temperatura.
- Bacterias: Las digestiones a menudo se llevan a cabo a 55 °C. Sin embargo, algunos artículos indicaron una temperatura de digestión de 37 °C. Tenga en cuenta los requisitos del tipo de muestra con la que estés trabajando y otros factores de tu experimento.
- Mamíferos: Los artículos son muy variados en las temperaturas de digestión. Los períodos de digestión más cortos generalmente se correlacionan con temperaturas más altas (las temperaturas óptimas de digestión de la proteinasa K para las células de mamíferos oscilan entre 50 y 65 °C). Los artículos con digestiones que se llevan a cabo durante varias horas o durante la noche generalmente sugerían 37 °C. Varios otros factores pueden afectar la temperatura de digestión, como el tipo de célula (sanguínea, bucal, etc.) y el peso molecular.
¿Cuánta proteinasa K utilizo?
La cantidad de proteinasa K que necesitas para una digestión exitosa dependerá de muchos factores: el protocolo que se está usando, el tipo de muestra con la que se está trabajando, las condiciones del experimento, etc. Por lo general, 10-20 µl de proteinasa K es usada en los experimentos, con concentraciones stock de proteinasa K normalmente alrededor de 20 mg/mL.
Otra cosa a tener en cuenta es que algunos métodos requieren un segundo paso de digestión (generalmente los que involucran muestras de tejido). Las segundas digestiones más débiles suelen requerir un volumen más bajo y un período de digestión diferente.
Para obtener más consejos sobre proteinasa K, visite la página del producto para obtener una lista de literatura relacionada o consulte nuestros artículos de preguntas comunes sobre la proteinasa K y la actividad de la proteinasa K.
Referencias
Bielawski, K., Zaczek, A., Lisowska, U., Dybikowska, A., Kowalska, A., & Falkiewicz, B. (2001). The suitability of DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for double differential polymerase chain reaction analysis. International Journal of Molecular Medicine.doi:10.3892/ijmm.8.5.573
Biase, F. H., Franco, M. M., Goulart, L. R., & Antunes, R. C. (2002). Protocol for extraction of genomic DNA from swine solid tissues. Genetics and Molecular Biology,25(3), 313-315. doi:10.1590/s1415-47572002000300011
Chen, Z. (n.d.). Zhibin’s Protocol of Tissue Processing for PCR genotyping. Zhejiang University. Retrieved July 17, 2018.
Derua, Y. A., Alifrangis, M., Hosea, K. M., Meyrowitsch, D. W., Magesa, S. M., Pedersen, E. M., & Simonsen, P. E. (2012). Change in composition of the Anopheles gambiae complex and its possible implications for the transmission of malaria and lymphatic filariasis in north-eastern Tanzania. Malaria Journal,11(1), 188. doi:10.1186/1475-2875-11-188
DNA EXRACTING FROM TOE PADS OR FEATHERS USING GENECLEAN II. (2005). Lougheed Genetics Laboratory Manual, Queens University. Retrieved July 17, 2018, from http://www.ispybio.com/search/protocols/dna_extractios_etc.pdf
DNA Isolation From Blood or Tissue Using Phenol/Chloroform. (2005). Lougheed Genetics Laboratory Manual, Queens University. Retrieved July 17, 2018, from http://www.ispybio.com/search/protocols/dna_extrac…
Fan, H., & Gulley, M. L. (2001). DNA Extraction from Fresh or Frozen Tissues. Molecular Pathology Protocols,5-10. doi:10.1385/1-59259-081-0:5
Feil, W., Feil, H., & Copeland, A. (2012, November 12). Bacterial genomic DNA isolation using CTAB [Web log post]. Retrieved July 16, 2018, from https://www.researchgate.net/profile/Ali_Mahmoudpo…
Goldenberger, D., Perschil, I., Ritzler, M., & Altwegg, M. (1995). A simple “universal” DNA extraction procedure using SDS and proteinase K is compatible with direct PCR amplification. Genome Research,4(6), 368-370. doi:10.1101/gr.4.6.368
Griffith, J. D., Comeau, L., Rosenfield, S., Stansel, R. M., Bianchi, A., Moss, H., & Lange, T. D. (1999). Mammalian Telomeres End in a Large Duplex Loop. Cell,97(4), 503-514. doi:10.1016/s0092-8674(00)80760-6
Gross-Bellard, M., Oudet, P., & Chambon, P. (1973). Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Cells. European Journal of Biochemistry,36(1), 32-38. doi:10.1111/j.1432-1033.1973.tb02881.x
Hrncirova, K., Lengerova, M., Kocmanova, I., Racil, Z., Volfova, P., Palousova, D., . . . Mayer, J. (2010). Rapid Detection and Identification of Mucormycetes from Culture and Tissue Samples by Use of High-Resolution Melt Analysis. Journal of Clinical Microbiology,48(9), 3392-3394. doi:10.1128/jcm.01109-10
Lum, A., & Marchand, L. (1998). A Simple Mouthwash Method for Obtaining Genomic DNA in Molecular Epidemiological Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention,7, 719-724. Retrieved July 17, 2018, from http://cebp.aacrjournals.org/content/cebp/7/8/719….
Meulenbelt, I., Droog, S., Trommelen, G., Boomsma, D., & Slagboom, P. (1995). High-Yield Noninvasive Human Genomic DNA Isolation Method for Genetic Studies in Geographically Dispersed Families and Populations. The American Society of Human Genetics.,1252-1254. doi:0002-9297/95/5705-0038$02.00
Mirmomeni, M., Ma, S. S., Sisakhtnez, S., & Doranegard, F. (2010). Comparison of the Three Methods for DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Biological Sciences,10(3), 261-266. doi:10.3923/jbs.2010.261.266
Parzer, S., & Mannhalter, C. (1991). A rapid method for the isolation of genomic DNA from citrated whole blood. Biochemical Journal,273(1), 229-231. doi:10.1042/bj2730229
Pikor, L. A., Enfield, K. S., Cameron, H., & Lam, W. L. (2011). DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses. Journal of Visualized Experiments,(49). doi:10.3791/2763
Rohland, N., & Hofreiter, M. (2007). Comparison and optimization of ancient DNA extraction. BioTechniques,42(3), 343-352. doi:10.2144/000112383
Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., & Berktas, M. (2014). Comparison of Methods for the Extraction of DNA from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. International Journal of Medical Sciences,11(5), 494-499. doi:10.7150/ijms.8842
Shahriar, M., Haque, M. R., Kabir, S., Dewan, I., & Bhuyian, M. A. (2011). Effect of Proteinase-K on Genomic DNA Extraction from Gram-positive Strains. Stamford Journal of Pharmaceutical Sciences,4(1). doi:10.3329/sjps.v4i1.8867
Steinau, M., Patel, S. S., & Unger, E. R. (2011). Efficient DNA Extraction for HPV Genotyping in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. The Journal of Molecular Diagnostics,13(4), 377-381. doi:10.1016/j.jmoldx.2011.03.007
Wilson, K. (2001). Preparation of Genomic DNA from Bacteria. Current Protocols in Molecular Biology,56(1). doi:10.1002/0471142727.mb0204s56
Zoetendal, E. G., Ben-Amor, K., Akkermans, A. D., Abee, T., & Vos, W. M. (2001). DNA Isolation Protocols Affect the Detection Limit of PCR Approaches of Bacteria in Samples from the HumanGastrointestinal Tract. Systematic and Applied Microbiology,24(3), 405-410. doi:10.1078/0723-2020-00060
Escrito por: Katherine Martin
Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.