a electroforesis en gel de agarosa es un método de biología molecular para analizar y separar fragmentos de ADN basados en su tamaño. Cuando usas una electroforesis en gel para ayudarte en clonación molecular, necesitarás ser capaz de interpretar y analizar los resultados de tu gel.
Por ejemplo, puedes necesitar cortar el plásmido digerido de agarosa. Sin embargo, cuando miras en el gel, podrás ver múltiples bandas en un mismo carril y preguntarte cuál deberías cortar.
En este artículo, revisaremos las diferentes formas del ADN plasmídico y ofreceremos consejos útiles para interpretar tu gel.
La Estructura de la Agarosa
La agarosa, producida de algas marinas, es un polisacárido. Durante la polimerización, los polímeros de agarosa se unen de forma no covalente y forman una red de paquetes. Esta red consiste de poros con propiedades de filtrado molecular.
Representación conceptual de un gel de agarosa bajo el microscópico
La separación de ADN ocurre debido a la naturaleza tipo malla del gel de agarosa. Fragmentos más pequeños de ADN pueden moverse rápidamente a través de los poros, mientras los fragmentos más grandes son atrapados y por tanto viajan más lentamente.
Demos una mirada a cómo la electroforesis de ADN en gel funciona.
Bajo un poderoso microscopio, un gel se verá poroso, pero al ojo humano, esto luce como una gelatina suave y opaca en forma de cuadrado con pozos cercanos al final de la superficie.
Un pozo es un bolsillo hueco en el gel donde el ADN es adicionado. Debido a que la unidad de fosfato está cargada negativamente, el ADN tiene una ligera carga negativa que le permite migrar al ánodo cargado positivamente. La distancia de viaje de las moléculas de ADN dentro de un gel de agarosa es proporcional al logaritmo de su peso molecular.
¿Cómo un Plásmido de ADN Circular Corre Durante una Electroforesis en Gel?
Las condiciones de la electroforesis en gel, incluyendo la presencia de bromuro de etidio, la concentración del gel, la fuerza del campo eléctrico, la temperatura, y la fuerza iónica del buffer de electroforesis, pueden afectar la movilidad del plásmido de ADN.
El atrapamiento electroforético es un equilibrio entre la fuerza electroforética (el arrastre del ADN plasmídico circular en contra de la trampa) y la difusión (que permite que el ADN plasmídico circular escape de la trampa). Entonces, las moléculas de ADN circulares grandes tienen una mayor probabilidad de quedar atrapadas que las formas de ADN más pequeñas.
El ADN superenrollado es más difícil de atrapar debido al pequeño tamaño del ADN retorcido.
4 Formas Comunes del Plásmido de ADN
Monómero Circular Covalentemente Cerrado (CCC)
El monómero circular covalentemente cerrado es un plásmido superenrollado y cargado negativamente. El plásmido intacto superenrollado tiene un ADN de doble hebra compacto y retorcido sobre sí mismo. El plásmido de ADN aislado de bacterias hospederas está usualmente presente en esta forma circular covalentemente cerrada. Los plásmidos de ADN sin digerir son usualmente superenrollados.
Monómero Circular Abierto (CA)
Una forma circular abierta es causada por el corte (clivaje) de una cadena de ADN. La radiación UV o las nucleasas pueden causar este corte de cadena sencilla. Esta estructura del plásmido es una forma relajada y menos compacta. Este plásmido también es menos superenrollado que la forma circular covalentemente cerrada.
Monómero Linear
La forma lineal es un resultado de un corte en ambas cadenas de ADN causado por endonucleasas de restricción.
Dímero Circular Abierto (CA), o “Concatémero“
Un dímero circular abierto (CA) es una forma oligomérica de un plásmido. Este dímero circular abierto, o concatémero, puede ocurrir debido a un proceso de replicación. Los dímeros son usualmente dobles en tamaño comparados a los monómeros.
Cómo interpretar los resultados de una electroforesis en gel de un plásmido de ADN
- En general, los monómeros superenrollados circulares y covalentemente cerrados se mueven más rápido que cualquier otra forma, debido a que tienen una estructura de ADN superenrollada y compacta. Por tanto, aparecerán en la parte más baja del gel.
- Los monómeros circular abierto (CA) y lineal, se mueven más lentamente que los monómero superenrollado circulares y covalentemente cerrados. Éstos tienen más dificultad para atravesar los poros de la matriz de gel que la forma circular covalentemente cerrada. Adicionalmente, las formas circulares abiertas aparecerán más arriba en el gel. El orden de migración usualmente es primero el monómero circular covalentemente cerrado (el más rápido), seguido de la forma lineal y luego la forma circular abierta.
- El plásmido de ADN digerido completamente usualmente muestra sólo una única banda en el gel, con forma lineal en su carril. El plásmido no digerido puede tener dos formas de aparecer en el carril: en forma de dímero circular covalentemente cerrado y de monómero circular covalentemente cerrado. Las formas diméricas debido a su mayor tamaño comparado a los monómeros, usualmente se mueven más lento que los monómeros. Por tanto, los dímeros aparecerán más arriba que los monómeros en el gel. La forma del monómero circular covalentemente cerrado corre más rápido que la forma lineal digerida del plásmido de ADN.
Ejemplos de formas plasmídicas en una electroforesis en gel. Carril 1: Marcador de peso molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Plásmido de ADN irradiado con luz UV.
Ahora, como práctica, ¿puedes identicar cada forma de plásmido de estas bandas del gel de agarosa a continuación?
Electroforesis en gel. Carril 1: Marcador molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido.
Respuesta:
En el carril 2, puedes visualizar dos bandas. La banda tenue en la parte superior es una forma circular abierta y la de abajo corresponde con la forma superenrollada circular covalentemente cerrada. Recuerda, la forma superenrollada circular covalentemente cerrada es más compacta que la circular abierta y puede viajar más lejos en el gel dentro de un margen de tiempo.
Para el carril 3, es el plásmido completamente digerido, así la banda tiene una forma lineal.
Consejos Para Identificar Bandas En Su electroforesis en Gel
Durante la electroforesis en gel, puedes cargar un plásmido de ADN no cortado, un fragmento de ADN digerido, producto de PCR o ADN genómico en los pozos. El próximo paso es identificar esas bandas. Para eso, te resumimos lo que hemos descrito en este artículo y unos consejos rápidos para ayudarte en la identificación.
- El plásmido de ADN sin cortar en el gel de agarosa es fácil de identificar debido a que éste puede tener dos formas del plásmido (las formas CA y la CCC).
- Plásmidos digeridos, fragmentos de ADN digeridos, productos de PCR, y ADN genómico, todos puede tener una sola banda. Para identificar estas bandas, deberás verificar el tamaño guiándote con el marcador de peso molecular de ADN. Tu plásmido digerido tiene una forma lineal con el tamaño entre las formas circular abierta y superenrollada circular covalentemente cerrado del plásmido no cortado. El ADN genómico será de mayor tamaño. Así, el ADN genómico usualmente se muestra en la parte más arriba del gel (muy cercano a su pozo de carga).
- Fragmentos de ADN digeridos pueden tener una única banda en un tamaño casi similar a su producto PCR.
Al final del carril del producto de PCR, podrás ver una banda tenue indicando pequeñas moléculas. Estas pequeñas moléculas son los primers (cebadores) que unen a otros cebadores para formar un dímero cebador.
Electroforesis en gel. Carril 1: Marcador de peso molecular de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Producto de PCR digerido (o fragmento de ADN). Carril 5: Producto de PCR (con una tenue banda de dímero cebador). Carril 6: ADN genómico.
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Referencias
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Escrito por: Tyas Kroemer
Traducido por: Adriana Gallego